Une astucieuse technique de microscopie en met plein la vue aux chercheurs : elle permet d’observer les molécules en pleine action sans les altérer. De quoi repousser les frontières de la science et accélérer la découverte de médicaments, entre autres pour la COVID-19.
« Attendez, je vais tourner la caméra. » Joaquin Ortega, avec qui je parle sur Zoom, me montre son deuxième ordinateur. La qualité de l’image par écrans interposés laisse à désirer, mais les petits amas que pointe le biochimiste se détachent clairement sur le fond grisâtre et granuleux. « Vous voyez ? Ce sont des ribosomes, les machines de la cellule qui fabriquent les protéines, m’explique-t-il avec une pointe d’excitation dans la voix. Le microscope est en train de prendre ces photos en direct. » L’instrument en question, situé dans des locaux de l’Université McGill, est en partie automatisé et peut être manipulé à distance par le chercheur, qui est à son domicile. Une chance en ces temps de pandémie.
Pour l’œil novice, ces petites boules agglutinées pourraient aussi bien être des poussières sur la lentille que des cellules grossies par n’importe quelle loupe un tant soit peu performante. Sauf que des cryomicroscopes électroniques comme celui-ci, il n’en existe qu’une poignée dans le monde. Et ces ribosomes sont en fait 1 000 fois plus petits qu’une cellule.
C’est simple, ce type d’appareil, qui utilise un faisceau d’électrons pour photographier des échantillons biologiques figés à -180 °C, offre désormais une résolution de quelques dixièmes de nanomètre. Assez pour voir des atomes individuels au sein d’une molécule, comme l’ont démontré simultanément deux équipes, l’une allemande et l’autre britannique, au printemps 2020. « Nous avons franchi l’ultime barrière de la résolution », s’était alors félicité Holger Stark, de l’Institut Max Planck de chimie biophysique, en Allemagne, qui a dirigé l’une des études. « Cela ouvre un tout nouvel univers », commentait son concurrent britannique, Radu Aricescu, dans la revue Nature. Car une fois les images grises superposées et nettoyées par ordinateur, les molécules se dévoilent avec une incroyable précision, telles des pelotes de laine dont on peut voir chaque boucle, chaque fibre en trois dimensions.
Et ce n’est pas tout : la cryomicroscopie électronique ou cryo-ME, qui a valu le prix Nobel à trois chimistes en 2017, repousse les frontières de la science en permettant de croquer ces molécules en action. Médicaments en train de bloquer une enzyme, complexes protéiques en plein assemblage, anticorps se fixant à leurs cibles ou virus attaquant une cellule : tout ou presque est désormais observable sur le vif, comme jamais auparavant. La technique, en additionnant des centaines de clichés, saisit les molécules sous tous les angles et dans toutes les orientations. « On voit la chimie en train de se faire », résume Joaquin Ortega.
À l’Université McGill, on ne cherche pas à égaler le record de la résolution atomique, mais on en est proche. « Surtout, ce cryomicroscope est le plus rapide du monde. Il produit 8 000 images par jour, soit deux fois plus que les autres modèles, grâce à des modifications qu’on a apportées l’an dernier », se réjouit le biochimiste. C’est lui qui a supervisé, avec Mike Strauss, un collègue expert en développement technologique, les « améliorations » de cet appareil de quatre mètres de hauteur de marque Titan Krios.
La Rolls-Royce des microscopes est prise d’assaut par des équipes de recherche venant de tout l’est du Canada, qui louent ses services. (L’Université de Toronto et celle de la Colombie-Britannique ont elles aussi, depuis peu, un Krios). « C’est de la folie, assure Joaquin Ortega, directeur de l’Installation de recherche en microscopie électronique de l’Université McGill, qui possède aussi trois autres modèles de cryomicroscopes moins puissants. Et la pandémie a fait exploser les demandes. »
Car pour trouver le talon d’Achille du SRAS-CoV-2, mettre au point des vaccins ou des traitements, quoi de mieux qu’espionner directement la bête ? Dès le début de mars 2020, la technique a révélé la structure du nouveau coronavirus et ses fameuses protéines S, dressées à sa surface comme autant de harpons prêts à s’accrocher à nos cellules. Une semaine plus tard, une équipe américaine photographiait ces harpons en pleine action, s’arrimant aux récepteurs ACE2 avec 10 fois plus de force que ceux du premier virus du SRAS. Presque tous les Titan Krios de ce monde ont été réquisitionnés ces derniers mois pour la cause.
Image: Paul Emsley / MRC Laboratory of Molecular Biology
La révolution
L’Université McGill a été particulièrement visionnaire en acquérant l’appareil en 2010. « Elle a acheté le troisième microscope sortant de l’usine ! » précise Joaquin Ortega. Mais à l’époque, le modèle avait beau être flambant neuf, son utilité restait limitée.
La cryomicroscopie électronique était d’ailleurs boudée, voire méprisée par la communauté scientifique. « Les autres biochimistes l’appelaient “blobologie” [le blob désigne une masse informe]. La résolution était mauvaise, les protéines avaient l’air de guimauves », se souvient Joaquin Ortega, qui travaille dans le domaine depuis 20 ans. C’est vrai qu’à côté de la cristallographie aux rayons X, technique de référence qui déduit à l’atome près les structures des protéines en les bombardant de rayons X, la cryo-ME avait peu d’intérêt…
D’autant que les instruments sont capricieux : en plus de leur taille démesurée, les cryomicroscopes sont sensibles aux variations de température et d’humidité ainsi qu’aux ondes électromagnétiques et aux vibrations. À l’Université McGill, il a fallu construire une salle dotée d’une dalle de béton de deux mètres d’épaisseur pour isoler l’appareil des vibrations de la route.
Imaginée dans les années 1980, la technique comble les lacunes de la microscopie électronique classique, qui nécessite de déshydrater l’échantillon, ce qui l’altère considérablement. La cryo-ME consiste à congeler très rapidement le matériel à observer, comme des protéines S de coronavirus isolées, avec de l’éthane liquide. Ce faisant, l’eau présente dans l’échantillon gèle sans former de cristaux : elle se vitrifie, figeant les molécules alentour sans les endommager. L’échantillon maintenu à -180 °C est ensuite placé dans un faisceau d’électrons. Avec leur longueur d’onde bien plus courte que celle des photons, les électrons permettent de distinguer des objets beaucoup plus petits que ceux visibles avec les microscopes optiques. En traversant les molécules, les électrons sont déviés de leur trajectoire et le détecteur capte ainsi l’empreinte de ce qu’ils ont rencontré en chemin.
« Pendant longtemps, les détecteurs devaient d’abord convertir les électrons en photons, ce qui donnait des images floues. Vers 2013, des détecteurs capables de capter directement les électrons ont fait leur entrée sur le marché. Ç’a été le tournant pour la cryo-ME, ce qu’on désigne comme la révolution de la résolution ! » explique Bridget Carragher, codirectrice du centre de microscopie électronique Simons au New York Structural Biology Center (NYSBC).
Avec ses sept Titan Krios et quatre autres cryomicroscopes, le NYSBC est le plus grand centre de cryo-ME du monde. Depuis le début de la pandémie, les instruments y fonctionnent à plein régime, nuit et jour, principalement pour l’analyse d’anticorps protecteurs contre la COVID-19. Bridget Carragher s’étonne encore quotidiennement des miracles accomplis par la technologie, qui a aussi tiré profit de meilleurs logiciels d’analyse d’images. « Ces cinq dernières années ont été complètement folles pour nous, qui étions une minicommunauté nichée. »
La minicommunauté a pris sa revanche. « Aujourd’hui, c’est le jeu des chaises musicales : les spécialistes du domaine sont courtisés par les universités et les entreprises pharmaceutiques du monde entier », s’amuse Joaquin Ortega.
Le Graal des biologistes
Hauts de près de quatre mètres, les cryomicroscopes électroniques doivent être installés à l’abri des vibrations et des ondes électromagnétiques. Ici, le Titan Krios du Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL) à Heidelberg, en Allemagne.
Julien Bergeron a assisté, lui aussi, à l’explosion de la cryo-ME. Formé à Seattle en 2014 sur l’un des premiers cryomicroscopes de nouvelle génération, il est aujourd’hui chercheur en biochimie au King’s College de Londres, où il partage un Titan Krios avec des collègues de deux autres universités. Son équipe travaille essentiellement sur des protéines de bactéries. Elle utilise également d’autres techniques d’observation, comme la cristallographie aux rayons X ou la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire. Toutes les deux offrent une excellente résolution, mais elles sont loin d’être parfaites (voir le tableau ci-plus bas dans cet article).
« Le problème avec la cristallographie, c’est qu’il faut d’abord forcer les protéines à cristalliser et c’est hautement imprévisible », souligne-t-il. Certaines protéines mettent des mois à s’organiser sagement en cristaux rigides, d’autres ne se prêtent jamais au jeu. Or, seul un cristal suffisamment robuste, constitué de milliards de protéines, peut supporter les rayons X et rendre leur diffraction interprétable.
Autre inconvénient de cette approche : elle « paralyse » les protéines. Or, ces minuscules machines qui régissent toutes les fonctions du vivant sont par essence mobiles et changeantes. Dans la cellule, elles se contractent et se détendent, s’ouvrent et se ferment, s’associent en complexes multiprotéiques, changent de forme quand elles se lient à un autre composé. La cristallographie ne capture pas ce dynamisme, au contraire de la cryo-ME. « En congelant des millions de protéines, on les fige dans toutes les orientations possibles, ce qui permet de reconstituer l’image en 3D. On peut voir d’un coup les différentes conformations d’une même protéine. On peut aussi figer un antibiotique lié à sa cible, ce qui permet d’observer le détail des interactions », énumère Julien Bergeron.
Or, capter les interactions, c’est le Graal des biologistes tant pour comprendre la fonction des molécules que pour concevoir de meilleurs traitements. « Cela permet d’entrevoir des applications incroyables, notamment pour cribler des médicaments et sélectionner ceux qui se fixent au bon endroit », poursuit le chercheur.
Des médicaments, plus vite !
La cryo-ME permet ainsi de visualiser les cibles les plus accessibles pour les médicaments, c’est-à-dire les protéines situées à la surface des cellules, quasi impossibles à examiner autrement, car elles cristallisent mal. Elles représentent 60 % des cibles thérapeutiques, mais elles ne constituent que 2 % des milliers de protéines dont la structure a été dévoilée jusqu’ici par la cristallographie aux rayons X. Depuis quelques mois, on ne compte plus les publications scientifiques qui livrent enfin les secrets des protéines de surface grâce à la cryo-ME !
Plutôt que de tester à l’aveugle des dizaines de milliers de molécules pour repérer lesquelles peuvent déjouer un agent pathogène ou une cellule cancéreuse par exemple, la cryo-ME permet de faire le chemin inverse : partir de la structure de la molécule cible, trouver le site d’accrochage ou les atomes avec lesquels on souhaite interférer et restreindre ainsi la recherche aux composés thérapeutiques les plus adaptés. « Beaucoup de modifications chimiques et de cycles de tests sont nécessaires avant qu’une molécule soit déclarée suffisamment prometteuse pour être testée chez l’humain, indique Mazdak Radjainia, gestionnaire du programme Cryo-EM Pharma chez Thermo Fisher Scientific, l’entreprise qui fabrique les Titan Krios et qui détient le quasi-monopole du marché. Connaître sa structure permet de raccourcir cette phase. »
Ce n’est donc pas pour rien que l’industrie pharmaceutique a sauté, elle aussi, dans le train de la cryo-ME. Une quinzaine d’entreprises, dont Merck, Novartis et Pfizer, se sont déjà dotées de leurs propres supermicroscopes. Elles y voient un moyen de gagner temps et argent. « Même si la technologie est très récente et que la découverte de médicaments prend du temps, la cryo-ME a déjà contribué à pousser de nouvelles molécules vers des essais cliniques », témoigne Mazdak Radjainia.
C’est le cas, entre autres, du vaccin contre la COVID-19 mis au point par Pfizer et BioNTech et du cocktail d’anticorps de Regeneron, administré à Donald Trump. La cryomicroscopie électronique a aussi aidé à élaborer un traitement expérimental contre la leishmaniose, une maladie parasitaire qui tue jusqu’à 40 000 personnes par année, et à enfin comprendre comment l’insuline se lie à son récepteur, ce qui pourrait un jour améliorer les traitements contre le diabète. Le cancer et les maladies neurologiques, dont l’alzheimer, sont également dans la ligne de mire des cryomicroscopistes.
L’entreprise québécoise Medicago, elle, a recouru au Titan Krios de l’Université McGill pour s’assurer que ses copies inoffensives du virus SRAS-CoV-2 qu’elle utilise en guise de vaccin avaient bien la forme sphérique requise, hérissée de protéines S. « Medicago était prioritaire : en moins d’une journée, on fournissait à l’équipe des centaines de clichés pour qu’elle puisse améliorer le produit », mentionne Joaquin Ortega.
L’imagerie moléculaire donne aussi un coup de pouce à la recherche de nouveaux antibiotiques, qui intéresse peu l’industrie, mais se poursuit dans les instituts publics. « La plupart des antibiotiques bloquent les ribosomes des bactéries pour les empêcher de fabriquer leurs protéines. Nous étudions la façon dont ces ribosomes s’assemblent − ils sont constitués de 50 morceaux différents − pour tenter de stopper en amont leur assemblage », dit Joaquin Ortega, qui décortique, image après image, cette machinerie complexe dans différentes bactéries.
Démocratisation
Aussi révolutionnaire soit-elle, la cryomicroscopie électronique est encore loin d’être la panacée. D’abord, les microscopes sont hors de prix. Ils coûtent sept millions de dollars à l’achat, mais il faut ensuite ajouter des milliers de dollars par jour de fonctionnement en maintenance, électricité, personnel… Sans compter les frais nécessaires à l’aménagement, voire la construction d’un local adapté. « Notre budget annuel est de 1,6 million de dollars. Tout le monde veut avoir accès à la cryo-ME, mais la technique n’est accessible qu’aux universités les plus fortunées », déplore Joaquin Ortega.
La préparation des échantillons, elle aussi, reste épineuse. « C’est encore un frein considérable, les protéines se cassent parfois, refusent de se placer en couches fines… Énormément d’efforts sont déployés en ce moment pour automatiser davantage la prise de photos et la préparation des échantillons », fait remarquer Bridget Carragher. Elle mise aussi sur l’intelligence artificielle, qui devrait faciliter le traitement des centaines d’images obtenues à chaque prise de vue. Un programme d’intelligence artificielle conçu par Deepmind a d’ailleurs démontré, le 30 novembre dernier, sa capacité à prédire la structure des protéines à partir de leur simple séquence d’acides aminés. Pas de quoi s’affranchir d’une visualisation en bonne et due forme pour l’instant, mais de quoi accélérer sans aucun doute la connaissance du monde du vivant.
Entretemps, Richard Henderson, l’un des pionniers du domaine à l’Université de Cambridge et lauréat du prix Nobel de chimie en 2017, s’est mis en tête de démocratiser la cryo-ME et travaille à la conception d’un appareil tout aussi performant que le Krios, mais plus compact, moins cher et moins gourmand en énergie. « Je pense qu’il va y arriver : quand cet homme dit quelque chose, il le fait, se réjouit Joaquin Ortega. Ce sera vraiment une avancée majeure. »
Le prochain défi consiste à observer directement ce qui se passe dans la cellule au lieu d’isoler les protéines à étudier, affirment d’une seule voix tous les experts interrogés. « Cela commence à être possible − c’est ce qu’on appelle la cryotomographie. On retire une bonne partie de l’épaisseur de la cellule et l’on fait bouger le spécimen pour prendre des images sous différentes inclinaisons, explique Bridget Carragher. Mais il reste encore beaucoup de travail pour améliorer la résolution et réussir à interpréter ce qu’on voit!»
Julien Bergeron partage cet enthousiasme : quel biologiste ne rêve pas d’espionner directement l’intérieur d’une cellule ? « Le potentiel est absolument immense. Ça va être difficile, mais excitant ! » Après des décennies de blobologie, la cryo-ME est sans aucun doute promise à un bel avenir.
Flagrant délit de mobilité
On a beau mener en laboratoire toutes sortes d’expériences, rien ne remplace l’observation directe. En particulier si elle se fait in vivo, avec une cellule ou un virus le plus intact possible.
C’est ce qu’a prouvé une équipe allemande en octobre dernier en jetant un œil à la fameuse protéine S du coronavirus, non pas en l’isolant, mais en la gardant fichée dans le virus, à l’état naturel, par cryotomographie. Au total, 1 000 virions, portant chacun une quarantaine de protéines S en moyenne, ont été observés. « En regardant les images, on s’est aperçus que la tige qui relie la tête de la protéine S au virus était souvent pliée, ce qui signifie qu’elle est mobile alors qu’on la pensait rigide », explique Jacomine Krijnse Locker, de l’Institut Paul Ehrlich, qui a supervisé l’étude.
Selon les simulations numériques, les protéines S ont même trois « articulations » leur permettant de sonder leur environnement, ce qui ne semble pas exister chez d’autres classes de virus comme le VIH ou la grippe. « Cette incroyable flexibilité pourrait permettre à chaque protéine S de se lier à plusieurs récepteurs et donc d’infecter les cellules plus efficacement », avance la chercheuse.
Autre constat de l’étude publiée dans Science : la protéine S est « lourdement décorée de glycanes », des chaînes de sucres qui viennent s’accrocher à la structure et peuvent influencer le repliement de la protéine, sa stabilité… et sa vulnérabilité. Comme un bouclier, « les glycanes peuvent empêcher les anticorps de se fixer, cela a donc des implications pour la recherche d’un vaccin », ajoute-t-elle. Les zones à nu, accessibles aux anticorps, doivent donc être visées en priorité.
Image en ouverture: Cette image du virus Zika est reconstituée à partir de milliers de clichés obtenus par cryomicroscopie électronique. Environ 180 protéines constituent l’enveloppe de ce virus. Image: www.virology.ws